Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Grain. --- Breadstuffs --- Cereal grains --- Cereals --- Grains --- Botany, Economic --- Field crops --- Flour --- Food --- Food crops --- Seed crops

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Arabinoxylan, afkomstig uit graangewassen, bestaat voornamelijk uit een beta-1,4 koppeling van xylose-eenheden die gesubstitueerd kunnen zijn met arabinose, beta-D-glucuronosyl of zijn 4-O-methyl derivaat, en/of met acetyl zijketens. Feruline- en/of p-coumarinezuur kunnen, via verestering met de C5-positie van sommige arabinose-eenheden, covalent verbonden zijn met de arabinoxylan-structuur (Hoofdstuk 1). Omwille van deze chemische en fysische complexiteit van arabinoxylan vereist een volledige enzymatische afbraak een verscheidenheid aan enzymen. De zijketens van de arabinoxylan-hoofdketen worden vrijgesteld door middel van alpha-L-arabinofuranosidase, beta-D-glucuronidase, feruloyl- en acetylxylan-esteraseactiviteit, terwijl het depolymeriseren van arabinoxylan steunt op de werking van endoxylanase- en beta-xylosidaseactiviteit (Hoofdstuk 2). Endoxylanasen werden gedurende de laatste 10 jaar aandachtig bestudeerd wegens hun grondige impact op de functionaliteit van arabinoxylan. Bijgevolg worden ze frequent toegepast in verscheidene industriële processen (Hoofdstuk 2). Ze worden regelmatig gebruikt in de broodbereiding en gluten-zetmeelscheiding omdat ze een gunstig effect hebben op het proces en/of het verbeteren van de kwaliteit van het eindproduct. Desondanks is de bruikbaarheid van endoxylanasen in dergelijke processen sterk afhankelijk van twee belangrijke enzym-eigenschappen, namelijk de substraatselectiviteit en de inhibitiegevoeligheid. Arabinoxylan komt in twee vormen voor: water-extraheerbaar en niet-water-extraheerbaar. Beide vormen hebben elk hun eigen fysicochemische eigenschappen (Hoofdstuk 1). Endoxylanasen kunnen enerzijds niet-water-extraheerbaar arabinoxylan hydrolyseren waarbij enzym-gesolubiliseerd arabinoxylan wordt vrijgesteld. Anderzijds kunnen zij water-extraheerbaar en enzym-gesolubiliseerd arabinoxylan degraderen tot arabinoxylanfragmenten met een laag moleculair gewicht. Afhankelijk van de industriële toepassing is een voorkeur van het endoxylanase voor één van beide vormen gewenst, terwijl de activiteit ten opzichte van de andere populatie ongewenst is (Hoofdstuk 2). Bijgevolg zal de substraatselectiviteit een belangrijke invloed hebben op de functionaliteit van deze enzymen. Een tweede belangrijke eigenschap is de inhibitiegevoeligheid. De aanwezigheid van proteïnen in graangewassen met endoxylanase inhiberende capaciteit kan een sterke invloed hebben op de functionaliteit van endoxylanasen. Tot op heden kon men drie verschillende inhibitoren isoleren, namelijk TAXI ( Triticum aestivum xylanase inhibitor), XIP (xylanase inhibitor protein) en TLXI (thaumatin-like xylanase inhibitor) (Hoofdstuk 3). De doeltreffendheid van arabinofuranosidasen in de afbraak van arabinoxylan wordt hoofdzakelijk bepaald door hun substraatspecificiteit en hun vermogen om diverse arabinosezijketens af te splitsen (Hoofdstuk 2). Afhankelijk van hun substraatspecificiteit, worden arabinofuranosidasen in drie groepen verdeeld. Type A hydrolyseert enkel arabinoseijketens van oligosachariden, type B hydrolyseert arabinosezijketens van zowel oligosachariden als polymeren en type C is enkel actief op arabinoxylo-oligosachariden en arabinoxylan. Arabinoxylan bevat zowel mono- als di-gesubstitueerde xylose-eenheden. De specifieke hydrolyse van één of beide substituenten bepaalt de voorkeur van deze enzymen. Het xylanolytische systeem van B. subtilis werd een tiental jaar geleden ontrafeld door middel van een genomische karakterisering. Niettegenstaande op deze manier de verschillende leden geïdentificeerd werden, waren enkele leden aan het begin van dit onderzoek nog niet gekarakteriseerd. In deze studie wordt de recombinante expressie, opzuivering en biochemische karakterisering van deze endoxylanasen en arabinofuranosidasen van B. subtilis beschreven. Bij de aanvang van dit doctoraatsonderzoek was één endoxylanase van B. subtilis , namelijk Bs XynA, beschikbaar als additief in de broodbereiding met als doel het broodvolume te vergroten. Om meer inzicht te krijgen in de selectiviteit en inhibitiegevoeligheid van Bs XynA, is het van cruciaal belang om een goed recombinant expressie-systeem gekoppeld aan een eenvoudig opzuiveringsprotocol te verkrijgen. Daarom werden twee organismen gescreend voor recombinante expressie, waarbij de expressie van de xynA coderende sequentie in Escherichia coli de hoogste opbrengst aan recombinant Bs XynA vertoonde. Dit recombinant enzym kan vervolgens gebruikt worden als referentie ten opzichte van de verschillende varianten, aangemaakt in Hoofdstukken 8 en 9. Groeiexperimenten met B. subtilis waarbij xylose als koolstofbron werd gebruikt, duidden op de secretie van nog twee andere vermeende endoxylanasen naast Bs XynA, namelijk Bs XynC en Bs XynD. Beide enzymen werden recombinant aangemaakt in E. coli en biochemisch gekarakteriseerd zoals beschreven in Hoofdstukken 5 en 6. Bs XynC, een glucuronoxylanase, vertoonde een voorkeur voor de hydrolyse van niet-water-extraheerbaar arabinoxylan naar enzym-gesolubiliseerd arabinoxylan. Ten tweede werd de activiteit van Bs XynC niet beïnvloed in aanwezig van inhibitoren. Omwille van deze twee eigenschappen werd Bs XynC getest in de broodbereiding (Hoofdstuk 5). Bs XynD daarentegen, vertoonde geen endoxylanaseactiviteit. Door zijn activiteit te testen op verschillende substraten, werd duidelijk dat Bs XynD gelijkenissen vertoonde met gekende arabinoxylan arabinofuranohydrolasen. Het hydrolyseerde namelijk alpha-L-arabinose van mono-gesubstiteerde xylopyranoside-eenheden (Hoofdstuk 6). Via een structurele analyse werd deze biochemische karakterisering bevestigd. Naast de twee endoxylanasen en het xylan arabinofuranohydrolase, werden door B. subtilis nog twee arabinofuranosidasen intracellulair tot expressie gebracht. De recombinante expressie, opzuivering en biochemische karakterisering wordt beschreven in Hoofdstuk 7. Gebaseerd op de biochemische karakterisering en een structureel model, kan verondersteld worden dat Bs AbfA enkel alpha-L-arabinose hydrolyseert van xylose-eenheden die aan het niet-reducerend uiteinde van het substraat gelegen zijn. Daarentegen hydrolyseert Bs Xsa enkel de alpha-L-arabinoseresidu's van de interne mono-gesubstituteerde xylose-eenheden. Gebaseerd op deze resultaten, kan verondersteld worden dat B. subtilis niet in staat is glucuronosyl- en di-gesubstituteerde arabinose-substituenten van xylose-eenheden af te splitsen. Om meer inzicht te krijgen in de mechanismen die aan de basis liggen van de belangrijkste enzym-eigenschappen die een invloed hebben op de functionaliteit van endoxylanasen in graanverwerkende toepassingen, namelijke endoxylanasesubstraatselectiviteit en inhibitiegevoeligheid, wordt plaatsgerichte mutagenese toegepast op BsXynA . Gebaseerd op de idee dat verschillen in oppervlakte-hydrofobiciteit van endoxylanasesn mogelijks verantwoordelijk zijn voor een verschillende endoxylanase substraatselectiviteit, werden endoxylanasen met lager aantal oppervlakte hydrofobe residu's ontwikkeld en aangemaakt (Hoofdstuk 8). Verscheidende varianten resulteerden in een lagere substraatselectiviteitsfactor in vergelijking met het wildtype endoxylanase. Dit weerspiegelt het belang van enkele specifieke aromatische residu's aan het oppervlak en/of nabijgelegen residu's in de substraatbinding bij de afbraak van arabinoxylan. Gebaseerd op het structureel inzicht van het complex tussen Aspergillus niger endoxylanase ExlA en TAXI-I, worden varianten van BsXynA ontwikkeld om het mechanisme van de inhibitiegevoeligheid, de tweede belangrijke parameter, te achterhalen (Hoofdstuk 9). Twee verschillende strategieën werden hierbij gebruikt: (i) introductie van sterische hindering of (ii) verbreking van de sleutelinteracties tussen inhibitor en endoxylanase ter hoogte van de substraat-bindingsgroeve. De eerste strategie werd met succes toegepast op positie G12 waar G12W inhibitie-ongevoeligheid combineert met een behouden katalytische werking. Varianten, gebaseerd op de tweede strategie, vertoonden een gewijzigde inhibitor-gevoeligheid samengaand met gewijzigde enzymactiviteit. Deze varianten lieten toe om meer inzicht te krijgen in de bindingsprocedure tussen TAXI-I en TAXI-II met Bs XynA. Arabinoxylans principally consist of a linear backbone of beta-1,4-linked D-xylopyranosyl units which are partially substituted with arabinofuranosyl residues. In addition to substitution by arabinose, the xylan backbone in cereals can be substituted with beta-D-glucopyranosyl uronic acid or its 4-O-methyl derivative, and/or with acetyl groups. Furthermore, ferulic acid and p-coumaric acid may be covalently linked to the arabinoxylan structure via esterification at the C5 position of some of the arabinofuranosyl units. Because of the heterogeneous composition of arabinoxylans (Chapter 1), their enzymatic degradation requires action of a battery of debranching and depolymerizing activities. Debranching activities mainly include alpha-L-arabinofuranosidases, feruloyl esterases, beta-glucuronidases, and/or acetyl xylan esterases, whereas depolymerization relies on endo-1,4-beta-xylanase and beta-xylosidase activities (Chapter 2). Endoxylanases have attracted a great deal of attention during the last decade because of their potential in many industrial processes as they have a profound impact on the functionality of arabinoxylan (Chapter 2). They are routinely used in several cereal-based industrial applications, such as bread-making and gluten-starch separation to improve processing and/or the quality of the final product. However, the functionality of endoxylanases in these applications is strongly influenced by two main enzyme characteristics, i.e. substrate selectivity and inhibition sensitivity. Arabinoxylan is present under a water-extractable and water-unextractable form, showing different physicochemical properties (Chapter 1). Endoxylanases can hydrolyse water-unextractable arabinoxylan, resulting in the release of enzyme-solubilized arabinoxylan and/or they can degrade water-extractable and enzyme-solubilized arabinoxylan to low molecular weight arabinoxylan fragments. Depending on the application, preferential attack by the endoxylanases of water-unextractable or water-extractable arabinoxylan is desired, while activity towards the other population is often undesirable (Chapter 2). As a result, the substrate selectivity of endoxylanases has a large impact on the functionality of these enzymes. Secondly, the presence of proteins capable of inhibiting endoxylanases in cereals also strongly influences the functionality of these enzymes. Nowadays, three different inhibitors have been isolated, i.e. TAXI ( Triticum aestivum xylanase inhibitor), XIP (xylanase inhibitor protein) and TLXI (thaumatin-like xylanase inhibitor) (Chapter 3). The efficiency of arabinofuranosidases in the degradation of arabinoxylan is mainly determined by their substrate specificity and their linkage preference (Chapter 2). Depending on their substrate specificity, arabinofuranosidases are divided in three main groups. Type A only releases arabinose from oligosaccharides, type B releases arabinose from oligosaccharides and polymers and type C is only active on arabinoxylo-oligosaccharides and arabinoxylan. Furthermore, as arabinoxylan contains mono- and di-substituted xylose moiety, the specific hydrolysis of these substituents by the arabinofuranosidases will determine the linkage preference. With the characterization of the genome of Bacillus subtilis , the puzzle of the xylanolytic system of B. subtilis was unraveled. Although members of this system were identified, still several of them were not characterized. This study describes the recombinant expression, purification and characterization of the endoxylanases and arabinofuranosidases of B. subtilis . At the beginning of this research, one endoxylanase of B. subtilis , namely Bs XynA, was available as it is used as an additive in the bread-making process to increase loaf volume. In order to gain insight in and to alter the substrate selectivity and the inhibition sensitivity of Bs XynA via site-directed mutagenesis, a recombinant expression system needed to be established, followed by a straightforward purification protocol. In Chapter 4, two different expression hosts were utilized. Expression of the xynA -encoding sequence in Escherichia coli resulted in high yield, sufficient to use recombinant Bs XynA as reference in comparison with the variants made in Chapters 8 and 9. Growth experiments of B. subtilis using xylose as carbon sources, indicated the secretion into the medium of two other putative endoxylanase next to Bs XynA, namely Bs XynC and Bs XynD. Both enzymes were recombinantly expressed in E. coli and biochemically characterized as described in Chapters 5 and 6. Bs XynC, a glucuronoxylanase, has a preference for solubilising water-unextractable arabinoxylans. As secondly, its activity was not influenced by the presence of proteinaceous inhibitors, it enabled us to test its potential in bread-making (Chapter 5). Bs XynD, on the contrary, did not display endoxylanase activity. Testing the activity on several substrates indicated that Bs XynD exhibited arabinoxylan arabinofuranohydrolase activity, hydrolysing alpha-L-arabinose from mono-substituted xylopyranosyl moieties (Chapter 6). Structural unravelling confirmed the biochemical characterization. In addition to two endoxylanases and one arabinoxylan arabinofuranohydrolase, B. subtilis expresses two intracellular arabinofuranosidases. The recombinant expression, purification and biochemical characterization is described in Chapter 7. Based on this biochemical characterization and a generated model, Bs AbfA probably only hydrolyses alpha-L-arabinose linked at the terminal non-reducing xylose moiety of the substrate. On the contrary, Bs Xsa releases alpha-L-arabinose residues of non-terminal mono-substituted xylose moieties. Based on the present results, it can be presumed that B. subtilis is unable to hydrolyse glucuronosyl and di-substituted arabinosyl substitutations of xylose moieties. To gain more insight in the underlying mechanism of the major enzyme characteristics that influences the functionality of endoxylanase in cereal-based applications, namely substrate selectivity and inhibition sensitivity, site-directed mutagenesis was performed on Bs XynA. Based on the idea that differences in the surface hydrophobicity of endoxylanases may influence the endoxylanase substrate selectivity, different Bs XynA variants with decreased levels of hydrophobic residues at the outer enzyme surface were designed and produced (Chapter 8). Several variants resulted in a lower substrate selectivity factor than their wild-type counterpart. The results imply the involvement of some specific surface aromatic residues and/or neighbouring residues in substrate binding and most likely also in the participation to the degradation of arabinoxylan. For the second par of the complex of Aspergillus niger ExlA endoxylanase and TAXI-I, was used to develop inhibitor-insensitive Bs XynA-variants (Chapter9). Two strategies were used: (i) inducing steric hindrance or (ii) interrupting the key interactions with the inhibitors in the endoxylanase substrate-binding groove. The first strategy was successfully applied to position G12 where G12W combined inhibition insensitivity with unharmed catalytic performance. Variants from the second strategy showed altered inhibitor sensitivities concomitant with changes in enzyme activities, allowing insight in the binding-mode of both TAXI-I and TAXI-II with Bs XynA. Arabinoxylan (AX) is een belangrijke component van de celwand bij planten. Na cellulose is AX het meest voorkomende polysacharide op aarde. Omwille van zijn complexiteit is een waaier aan enzymatische activiteit noodzakelijk om dit polysacharide te degraderen tot zijn basiseenheden of oligosachariden. De belangrijkste enzymen in dit degradatieproces zijn endoxylanasen en arabinofuranosidasen. Endoxylanasen werden gedurende de laatste 10 jaar aandachtig bestudeerd wegens hun grondige impact op de functionaliteit van AX. Bijgevolg worden ze frequent toegepast in verscheidene graanverwerkende industriële processen om de procescondities en de kwaliteit van de eindproducten te verbeteren. De functionaliteit van endoxylanasen in deze toepassingen is echter vaak niet goed begrepen. Dit is voornamelijk te wijten aan het feit dat hun substraten aanwezig zijn onder een water-extraheerbare (WE-AX) en een niet-water-extraheerbare (WU-AX) vorm, gekenmerkt door verschillende fysicochemische eigenschappen. Endoxylanasen kunnen enerzijds WU-AX hydrolyseren waarbij enzym-gesolubiliseerd arabinoxylan (ES-AX) wordt vrijgesteld. Anderzijds degraderen zij WE-AX en ES-AS tot AX-fragmenten met een laag moleculair gewicht. Afhankelijk van de industriële toepassing is een voorkeur van het endoxylanase voor één van beide vormen gewenst, terwijl de activiteit ten opzichte van de andere populatie ongewenst is. Een tweede belangrijke enzym-eigenschap van endoxylanasen is de inhibitiegevoeligheid. De aanwezigheid van proteïnen in graangewassen met endoxylanase inhiberende capaciteit kan een sterke invloed hebben op de functionaliteit van endoxylanasen. Tot op heden kon men drie verschillende inhibitoren isoleren, namelijk TAXI (Triticum aestivum xylanase inhibitor), XIP (xylanase inhibitor protein) en TLXI (thaumatin-like xylanase inhibitor). De doeltreffendheid van arabinofuranosidasen in de afbraak

Academic collection --- 66.098 --- 664.6/.7 --- 664.6/.7 Technology and processing of cereal grains. Milling, baking etc. --- Technology and processing of cereal grains. Milling, baking etc. --- 66.098 Biological processes. Biotechnology --- Biological processes. Biotechnology --- Theses

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Grain. --- Millets. --- Millet --- Grasses --- Breadstuffs --- Cereal grains --- Cereals --- Grains --- Botany, Economic --- Field crops --- Flour --- Food --- Food crops --- Seed crops

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Grain --- Breeding. --- Genetic engineering. --- Breadstuffs --- Cereal grains --- Cereals --- Grains --- Botany, Economic --- Field crops --- Flour --- Food --- Food crops --- Seed crops

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

664.6/.7 --- Cereals as food --- Cereal products --- 664.7 --- Bier --- Brood --- Brouwerij --- Deegwaren --- Graan --- Graanindustrie --- Graanmaalderij (maalderij, malen) --- Mout --- Ontbijtgranen --- Snacks --- Grain products --- Seed products --- Food --- 664.6/.7 Technology and processing of cereal grains. Milling, baking etc. --- Technology and processing of cereal grains. Milling, baking etc. --- Technology and processing of cereal grains. Milling, baking etc --- #KVIV:BB